サンプル調製の最適化からデータ解釈まで
シングルセル解析支援
シングルセル解析ではサンプル（細胞や核）のクオリティが最も重要です。事前に細胞や核の単離条件を検討する必要があり、シングルセル解析に適したサンプルを準備できるようコンサルティングを実施します。シングル核RNA-seqの場合は凍結組織から核の単離を行うことができますが、組織によっては組織を分散する際に多くのデブリスが発生し、核の単離に加えてデブリスを除去する操作が必要となる場合があります。
これまでの経験をもとに各々のサンプルに適した条件をご提案します。また、バイオインフォマティクス解析においてもお客様の研究目的に沿った解析方法の提案および解析の実施、解析データの解釈といったコンサルティングも実施しています。
細胞とバーコード付きのビーズが
液滴中に分離
Gel Beads-in-emulsion（GEMs）技術
ゲルビーズの表面は、オリゴヌクレオチドでコーティングされていて、以下の配列から構成されています。
- TruSeq/Nextera Read1
- 10X Genomics Barcode（16塩基）
- 分子バーコード
3’遺伝子発現解析の場合：12塩基
5’遺伝子発現解析の場合：10塩基 - Poly(dT)VN（30塩基）
V：A、C、Gのいずれか
N：A、T、C、Gのいずれか
解析の流れ
細胞/核の品質確認
いくつかの基準を元にお客様にご準備いただいたサンプルがシングルセル解析に適しているか評価を実施し、ライブラリ作製へと進みます。
ライブラリー調製
Chromiumでは、従来のバルクRNA-seqでは解析できなかった、1細胞レベルでの網羅的な発現解析ができます。
Visiumでは、組織全体のトランスクリプトームの発現プロファイルを網羅的に解析できるのに対して、Xeniumではターゲットとする数千種類の遺伝子発現を個々の細胞または細胞内の位置情報とともに解析できます。
シーケンシング
価格やご希望に応じてDNBSEQまたはNovaSeqを用いたシークエンスを実施しております。
シーケンサーのご希望がある場合には事前にご相談ください。
データQC・フィルタリング
nFeature_RNA (各細胞で確認された遺伝子数)、nCount_RNA（各細胞で確認されたRNA数）、percent.mt（ミトコンドリアにマッピングされたリードの割合）といった各細胞の指標を確認し、低クオリティな細胞を取り除きます。
次元圧縮・クラスタリング
UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）
数千〜数万にもおよぶ細胞ごとの遺伝子発現パターンを、人が目で見て理解できる2次元の散布図に落とし込みます。
Clustree
クラスタリング数を制御しているパラメーター（resolution）を変化させたときにどのように細胞が分類されるかといったクラスタリングの過程、関係性を可視化します。
Bar Plot
各クラスターにどのサンプル由来の細胞がどの程度存在するか確認できます。
